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如何選擇液相色譜柱

更新時(shí)間:2014-07-04 瀏覽次數(shù):4013

 

    現(xiàn)代液相色譜中,分離效果好壞的一個(gè)重要指標(biāo)是色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬,因此,要做合適的選擇,必須對(duì)此有一定的認(rèn)識(shí)和了解。
    一、硅膠基質(zhì)填料 
    1、正相色譜。正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)以及其他具有極性官能團(tuán)胺基團(tuán),如(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN,CPS)的鍵合相填料。
    由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他極性基團(tuán)極性較強(qiáng),因此,分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小,即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低,如正已烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene Chloride)
    2、反向色譜。反向色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì),表面鍵合有極性相對(duì)較弱官能團(tuán)的鍵合相。反向色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng),通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分zui先被沖洗出,而極性弱的組分會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。
    常用的反向填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
    二、聚合物填料。聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等,其重要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1—14均可使用。相對(duì)于硅膠基質(zhì)的C18填料,這類填料具有更強(qiáng)的疏水性;大孔的聚合物對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?,F(xiàn)有的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料,色譜柱柱效較低。
    三、其它無機(jī)填料。其它HPLC的無機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化由于其特殊的性質(zhì),一般于特殊的用途。如,石墨化碳黑正逐漸成為反向色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相,石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ),不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合相硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體,由于在HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解,這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用于HPLC。氧化鋁微粒剛性強(qiáng),可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床,其優(yōu)點(diǎn)是可以在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物的作用也很強(qiáng),應(yīng)用范圍受到一定限制,所以未能廣泛應(yīng)用。新型色譜氧化鋯基質(zhì)填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱,應(yīng)用PH1-14,溫度可達(dá)100。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究,加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度,其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行之中。
    怎樣選擇填料粒度。目前,商品化的色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售,而目前分析分離主要用3和5um填料進(jìn)行。填料的粒度主要影響填充柱的兩個(gè)參數(shù),即柱效和背壓。粒度越小,柱壓越大,柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度,但不是*的因素。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時(shí),柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱,即相同的塔板數(shù)或分離能力,但是柱長更短,以縮短分析時(shí)間。另外,可以采用低粘度的溶劑做流動(dòng)相或增加色譜柱的使用溫度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色譜柱的壓力。 

色譜柱維護(hù) 
1防止色譜柱堵塞 
原因1:溶劑中的不溶物 
 — 應(yīng)使用色譜純?nèi)軇?,膜過濾(孔徑不超過0.45μm) 
原因2:樣品中的不溶物 
 — 應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行膜過濾(孔徑不超過0.45μm) 
原因3:泵,進(jìn)樣器等中的不溶物 
—  在泵和進(jìn)樣器之間安裝內(nèi)置過濾器,在進(jìn)樣器和柱之間安裝預(yù)過濾器 
原因4:柱內(nèi)不溶物的形成 
4-1.由于溶劑的不互溶而產(chǎn)生的沉淀 
—用能溶解沉淀物的溶劑沖洗色譜柱 
4-2.在不互溶溶劑中由于進(jìn)樣而產(chǎn)生的沉淀 
    —檢查樣品液和流動(dòng)相是否互溶 
4-3.由于溫度的改變或固定相的干涸而產(chǎn)生的沉淀 
—將色譜柱密封緊,并保持室溫恒定 
操作壓力上升故障排除 
HPLC系統(tǒng)流程圖: 
吸入過濾器>>泵>>內(nèi)置過濾器>>進(jìn)樣器>>預(yù)過濾器>>保護(hù)柱>>主分析柱>>檢測(cè)器 
和排放系統(tǒng) 
從流程圖的末端依次斷開部件,如從檢測(cè)器開始斷開,zui容易引起阻塞的部件是: 
預(yù)過濾器,保護(hù)柱和主分析柱 
[注]:應(yīng)記錄新柱子在常規(guī)分析條件下的操作壓力 
2柱堵塞的修復(fù) 
步驟1:使用含鹽緩沖液后(如離子對(duì)試劑)應(yīng)用溶解性強(qiáng)的溶劑(如水)進(jìn)行沖 
洗 ;
步驟2:先斷開檢測(cè)器,然后用對(duì)來自樣品中的物質(zhì)有強(qiáng)溶解性的溶劑進(jìn)行沖洗。 
對(duì)于反相色譜柱,可使用甲醇,乙睛,*,氯仿,庚烷等,在此條件下,應(yīng) 
避免溶劑的pH低于2或高于8;
若經(jīng)過步驟1和步驟2后,壓力仍沒下降至步驟3 
步驟3:斷開檢測(cè)器,將色譜柱反方向放置,然后檢查柱壓 
1)若壓力穩(wěn)定下降,至步驟4 

2)若壓力不下降,至步驟5 
步驟4:保持色譜柱反方向連接,用低于0.5 ml/min 流速?zèng)_洗1小時(shí) 
若步驟4不能降壓,至步驟5 ;
步驟5:若內(nèi)置過濾器被堵塞,應(yīng)沖洗或更換。柱連接端的拆卸或重裝會(huì)導(dǎo)致柱效 
下降,(有效塔板數(shù)下降和不對(duì)稱峰),若步驟5不能降低柱壓,至步驟6 
步驟6:若進(jìn)口端的填料發(fā)生堵塞,柱子將不可能被*恢復(fù),只能通過去掉進(jìn)口 
端的部分填料,重新填充進(jìn)行有限的柱效恢復(fù)。(2~5mm) ;
[注]:在多數(shù)情況下,柱效將嚴(yán)重地下降 
步驟7:若步驟6無法改善柱子性能,那么柱子已無法修復(fù),請(qǐng)注意當(dāng)拆開連接端時(shí) 
柱子已不再得到質(zhì)量保證。 
柱效的下降:
導(dǎo)致柱有效塔板數(shù)和分離能力下降的主要原因是固定相的惡化和硅膠表面活性鏈的 
損失,在這些條件下柱子已不可能再恢復(fù)

色譜柱的使用

1、色譜柱的使用說明: 
 ?。?)色譜柱使用前注意事項(xiàng):色譜柱的儲(chǔ)存液無特殊說明,均為評(píng)價(jià)報(bào)告所示的流動(dòng)相。在使用前,一定要注意色譜柱的儲(chǔ)存液與要分析樣品的流動(dòng)相是否互溶。在反相色譜中,如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑,應(yīng)先用10%左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過渡一下,否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出,堵塞色譜柱。
 ?。?)流動(dòng)相:流動(dòng)相中所使用的各種有機(jī)溶劑要盡可能使用色譜純,配流動(dòng)相的水是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動(dòng)相再經(jīng)過0.45μm的濾膜過濾一次則zui好,尤其是含鹽的流動(dòng)相。另外,裝流動(dòng)相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
  以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的PH值適用范圍是2.0-8.0,BDS C18適合于堿性化合物,PH值適用范圍為2.0-10.0。當(dāng)必須要在PH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時(shí),每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲(chǔ)存并與所使用的流動(dòng)相互溶的溶劑清洗,并*置換掉原來所使用的流動(dòng)相。
 ?。?)樣品:樣品也要盡可能清潔,可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱(SPE)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理;若樣品不便處理,要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時(shí),所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。
  2、色譜柱的保存 
  (1)反相色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng):使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,洗掉色譜柱中的鹽,再用甲醇沖洗30分鐘。注意:不能用純水沖洗柱子,應(yīng)該在水中加入10%的甲醇,防止將填料沖塌陷。
  (2)長期保存色譜柱:如色譜柱要長時(shí)間保存,必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中,正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中,離子交換柱可以儲(chǔ)存于水(含防腐劑*或柳硫汞)中,并將購買新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度是室溫。
  3、色譜柱的再生 
  因?yàn)樯V柱是消耗品,隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加,會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低,峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象,一般來說可能是柱效下降。
 ?。?)反相柱的再生:依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90 (V/V),乙腈,異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱,完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
 ?。?)正相柱的再生:依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱,然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。
  4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 
  色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高,如果柱壓是在長時(shí)間使用過程中緩慢增加,屬于正?,F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高(系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外),以下列舉了部分常見原因及解決辦法:
 ?。?)色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染;
  解決方法:如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,或者卸下色譜柱頭,將其放在10%的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,后再用純水超聲10分鐘,重新裝入色譜柱。
 ?。?)色譜柱頭的填料被樣品污染;
  解決方法:如確定色譜柱頭的填料被污染,將柱頭螺絲卸下,挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔細(xì)修復(fù)后,重新安裝上柱頭螺絲。
 ?。?)色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑,形成結(jié)晶析出; 解決方法:如確定定是鹽結(jié)晶,用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,再換高濃度甲醇。
  (4)流動(dòng)相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決方法:如果因PH值使用不當(dāng),很難恢復(fù) 液相色譜儀由高壓液體泵、檢測(cè)器及液相色譜柱等三部分組成,其中液相色譜柱的正確安裝和使用,是液相色譜工作的關(guān)鍵;也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
  一、液相色譜柱的安裝:
  1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu):
  a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
  柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時(shí),用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。
  在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失??罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
  b、柱填料:
  液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的,柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
  正相柱:多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10
μm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
  反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
  常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 μm之間。
  2、色譜柱的安裝:
  a、拆開柱包裝盒,確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
  b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
  c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護(hù)柱);柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,然后順時(shí)針擰緊空心螺釘,直到擰不動(dòng)為止,再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象,請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4圈,直至不漏液為止。
  二、液相色譜柱的使用:
  色譜柱在使用前,進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是*條件),只有樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
  1、樣品的前處理:
  a、使用流動(dòng)相溶解樣品。
  b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
  c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
  2、流動(dòng)相的配制:
  液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn):
  a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。
  b、流動(dòng)相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
  c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
  d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
  e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
  f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
  3、流動(dòng)相流速的選擇:
  因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
  當(dāng)選用*流速時(shí),分析時(shí)間可能延長。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
  注意:
  a.由于甲醇廉價(jià),對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。
  b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相,沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐),去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),有可能影響分析結(jié)果。
  c.含水流動(dòng)相zui奸在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要隔夜。加入*,防止細(xì)菌生長。
  d.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
  e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相,使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
  4、柱性能測(cè)試:
  啟動(dòng)液相色譜儀:a、流動(dòng)相流速設(shè)定為1ml/min。
  b、UV檢測(cè)器波長設(shè)定為254nm。
  使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。
  記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。

2、色譜柱的保存 

(1)反相色譜柱每天實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng):

使用緩沖液或含鹽的流動(dòng)相,實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)用10%的甲醇/水沖洗30分鐘,洗掉色譜柱中的鹽,再用甲醇沖洗30分鐘。注意:不能用純水沖洗柱子,應(yīng)該在水中加入10%的甲醇,防止將填料沖塌陷。

(2)長期保存色譜柱:

如色譜柱要長時(shí)間保存,必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以儲(chǔ)存于純甲醇或乙腈中,正相柱可以儲(chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中,離子交換柱可以儲(chǔ)存于水(含防腐劑*或柳硫汞)中,并將購買新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度是室溫。

3、色譜柱的再生  

因?yàn)樯V柱是消耗品,隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加,會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低,峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象,一般來說可能是柱效下降。

(1)、反相柱的再生:依次采用20-30倍的色譜柱體積的甲醇:水=10:90 (V/V),乙腈,異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱,完成后再以相反順序沖洗色譜柱。

(2)、正相柱的再生:依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱,然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。

4、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 

色譜柱在使用中zui常見的問題就是柱壓升高,如果柱壓是在長時(shí)間使用過程中緩慢增加,屬于正?,F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高(系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外),可能的原因有如下幾點(diǎn):

(1)色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染;

(2)色譜柱頭的填料被樣品污染;

(3)色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑,形成結(jié)晶析出;

(4)流動(dòng)相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。

解決辦法如下:

(1)如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染,可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力,或者卸下色譜柱頭,將其放在10%的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘,后再用純水超聲10分鐘,重新裝入色譜柱。

(2)如確定色譜柱頭的填料被污染,將柱頭螺絲卸下,挖出柱內(nèi)前段被污染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔細(xì)修復(fù)后,重新安裝上柱頭螺絲。

(3)如確定定是鹽結(jié)晶,用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解,再換高濃度甲醇。

(4)如果因PH值使用不當(dāng),很難恢復(fù)。

 

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